Film Osama ini menceritakan tentang rezim Taliban yang memerintah Afganistan, selama Taliban memerintah, mereka menjadi rezim yang refresif bagi perempuan. Karena Taliban tidak memperbolehkan wanita untuk bekerja. Situasi ini sulit bagi keluarga yang hanya terdiri dari tiga wanita, yang mewakili tiga generasi berturut-turut. Inilah yang di rasakan oleh keluarga Osama. Semua laki-laki dalam keluarga mereka telah wafat oleh medan perang yang terjadi di Afganistan. Sang ibu telah bekerja sebagai perawat di salah satu rumah sakit, tetapi Taliban melarang wanita untuk bekerja dan telah memotong dana untuk rumah sakit. Hal itu menyebabkan keluarga ini terpuruk ekonominya untuk bertahan hidup. Ibu dan nenek memikirkan cara untuk itu, alhasil mereka menemukan sebuah ide. Mereka akan mengorbankan putri mereka Osama untuk melancarkan ide tersebut. Osama akan menyamar sebagai anak laki-laki sehingga dia akan dapat pekerjaan untuk mendukung ekonomi keluarganya. Nenek menceritakan sebuah kisah kepada Osama tentang anak yang berubah menjadi seorang gadis ketika dia pergi di bawah pelangi, nenek melakukan itu untuk membujuk Osama menerima rencana tersebut.
Osama merasa tidak berdaya, dia pun setuju dengan rencana tersebut meskipun takut bahwa Taliban akan membunuhnya jika samaran dia ketahuan. Satu-satunya orang yang tahu samarannya selain keluarga adalah tukang susu yang mempekerjakannya, karena dia merupakan teman dari almarhum ayahnya dan seorang anak laki-laki lokal bernama Espandi.
Taliban memberikan sekolah yang meliputi pelatihan militer kepada anak laki-laki lokal. Di sekolah pelatihan, mereka diajarkan bagaimana untuk melawan dan melakukan wudhu. Wudhu yang diajarkan kepada anak laki-laki adalah ketika mereka kelak mengalami mimpi basah atau ketika dewasa nanti akan bersentuhan dengan istri mereka. Osama mencoba untuk menghindari bergabung pada sesi wudhu, karena takut ketahuan bila sebenarnya dia adalah wanita. Walaupun Espandi pada awalnya mampu melindunginya dari anak laki-laki yang mulai curiga pada Osama karena tidak pernah memperlihatkan tubuhnya, akhirnya rahasianya terbuka ketika dia haid.
Osama pun ditangkap dan diadili, bersama dengan seorang jurnalis Barat, dan wanita asing yang ditangkap di rumah sakit. Wartawan dan perawat keduanya dikutuk dan dihukum mati, tapi Osama yang malang dan tak berdaya terhindar dari hukuman mati. Namun, sayangnya dia di nikahkan oleh orang yang sangat jauh lebih tua. Suami baru Osama sudah memiliki tiga istri, yang semuanya membencinya dan mengatakan bahwa dia telah menghancurkan kehidupan mereka. Tetapi, para istri tersebut tersentuh hatinya dan kasihan terhadap Osama tapi tidak dapat membantunya. Film berakhir dengan suami yang melaksanakan wudhu yang dijarkan kepada anak laki-laki setelah kontak dengan istri mereka.
